Suggerimenti di base per la crioconservazione delle colture cellulari

Suggerimenti di base per la crioconservazione delle colture cellulari

Le cellule continuano il loro metabolismo durante le normali attività di crescita, che richiedono la partecipazione di varie proteasi. Quando la temperatura scende al di sotto di -70 ° C, le proteasi smettono di funzionare. Pertanto, in un ambiente con temperature estremamente basse, le cellule possono fermare le loro attività metaboliche ed entrare in uno stato dormiente che consente la conservazione a lungo termine.

1. Materiali sperimentali

Materiale di base:

Terreno di coltura di base

Siero (FBS/NBS convenzionale)

Banco da lavoro ultrapure

Dimetil solfossido sterile (DMSO)

Soluzione tampone fosfato sterile PBS

Pistola con pipetta

Pistola con pipetta elettrica

Preparazione degli esperimenti

a) Preparazione della soluzione di congelamento:

Cellule generali: mezzo basale 55% + 40% siero bovino (FBS/NBS) + 5% DMSO

Cellule vitali: siero bovino al 90% (FBS/NBS) + 10% DMSO

Aliquota la soluzione di crioconservazione preparata in un tubo di centrifuga da 15 ml [nido] e conservare a 4 ° C per un uso successivo.

(b) Preparazione di cellule da congelare:

Prima di congelare le cellule, selezionare le cellule con un buon stato di crescita e nella fase di crescita logaritmica e sostituirle con mezzo fresco 12-24 ore prima del congelamento per mantenere le condizioni cellulari.

2. Procedura sperimentale

1. Osservare la densità delle cellule da congelare, che è di circa l'80%~ 90%. Usa una pistola pipetta per aspirare il vecchio mezzo, aggiungere PBS sterile per lavare le cellule 1-2 volte e rimuovere il mezzo rimanente nell'ambiente di coltura.

2. Aggiungere una quantità adeguata di tripsina o succo digestivo per consentire alla tripsina di entrare nelle celle e posizionarle nell'incubatore per la digestione. Osservare le condizioni delle cellule al microscopio: il citoplasma si sta ritirando e le cellule non sono più collegate ai fogli. A questo punto, aggiungi la soluzione di arresto per fermare il processo di digestione.

3. Svolgi delicatamente le cellule con una punta per formare una sospensione cellulare e centrifugare la sospensione cellulare a 1000 giri / min per 3-5 minuti.

Scartare il surnatante, aggiungere una quantità adeguata di soluzione di congelamento e pipetta delicatamente per far contare le celle uniformemente. Regolare la densità cellulare con mezzo di crioconservazione per rendere la densità finale 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml.

4. Utilizzare una pistola pipetta per separare i tubi criogenici in base alla capacità prevista e utilizzare una macchina per tappatura automatica per tappo e sigilla.

5. Il programma di crioconservazione standard è una velocità di raffreddamento da -1 ° C a -2 ° C/min e le cellule da congelare possono essere gradualmente congelate in base ai seguenti passaggi: Temperatura ambiente → 4 ° C (20 minuti) → - 20 ° C (30 minuti) → -80 ° C ° C (durante la notte) → Conservazione a lungo termine in azoto liquido.

Può anche essere conservato direttamente in un congelatore a -80 ° C durante la notte e quindi trasferito in azoto liquido per la conservazione.

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